包埋與冷凍 (Embedding and Freezing)
- 原理：壓平後，檢體在水平 (level) 配置下冷凍，並以包埋介質 (embedding medium) 如 optimal cutting temperature (OCT) medium 或類似化合物製成支撐塊；介質將組織黏到夾頭 (chuck) 上，並在冷凍切片 (cryosectioning) 期間包覆支撐，防止組織流失（俗稱 chunking out）。
- 三種常用包埋法：reverse slide mount 法、embedding wells、cryo-embedder system。
Reverse slide 法步驟
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- 組織深面朝下 (deep side down) 貼在玻片上；輕壓檢體周邊使其與玻片完全接觸並擠出氣泡；可用 freeze spray 輔助以防表皮翹起 (Fig. 29-11)。
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- 施加 OCT 等封固介質，將組織、包埋介質與玻片冷凍至約 −15° 至 −30 °C；可用 liquid nitrogen、tetrafluoroethylchloride 或 methoxynonafluorobutane 輔助，直到介質凍結（變不透明）(Fig. 29-12)。
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- 在 cryostat 夾頭上放少量包埋介質 (Fig. 29-13)。
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- 將仍在玻片上的檢體倒扣到夾頭上形成最終塊；可再加包埋介質 (Fig. 29-14)，使檢體凍結於夾頭；可用 copper fitting 或 heat sink 加速；數分鐘後移除玻片，露出平滑、水平的塊面，使深部邊緣與表皮緣於同一平面供切片。
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- 將檢體塊放入 cryostat 開始切片 (Fig. 29-15)。
常見問題
- 冷凍太慢：冰晶 (ice crystals) 會在組織留下孔洞；潮濕環境凝結也會形成冰晶造成裂縫與孔洞。
- 檢體捲曲 (curling)：可能因 cryostat 切片刀不夠冷，或室內濕度過高。
- 脂肪組織需強力冷凍，可能增加表皮冷凍假影 (freeze artifact)、組織裂痕與檢體碎裂 (chipping)。
圖 29-11：(A,B) 將上墨、鬆弛後的組織深面朝下放在標記好的玻片上，用鑷子把組織邊緣壓平於玻片。(C) 常需 freeze spray 幫助組織以平整配置固定於玻片；壓平讓表皮、真皮、皮下脂肪位於同一平面。
圖 29-14：(A) 在組織上加更多包埋介質。(B) 檢體倒置於夾頭並加更多介質，續冷卻。(C) 用 heat sink 或 extractor 加速冷凍，數分鐘後可將玻片自組織彈離供包埋，使手術邊緣露出於同一平面；若玻片難分離可用溫熱拇指加溫玻片；可塗一層介質填補塊面空隙以利切片並防 chunking out。