包埋與冷凍 (Embedding and freezing)
一旦壓平後，檢體即在此水平配置 (level configuration) 下被冷凍，並以包埋介質 (embedding medium) 形成的塊體支撐，例如 optimal cutting temperature (OCT) medium 或類似化合物。包埋介質將組織黏結於卡盤 (chuck) 上，並在冷凍切片 (cryosectioning) 階段環繞並支撐組織。此舉可防止處理過程中的組織流失，俗稱為脫塊 (chunking out)。最常用的包埋方法為反向玻片貼附法 (reverse slide mount method)、包埋井 (embedding wells)，以及冷凍包埋系統 (cryo-embedder system)。反向玻片法的步驟如下：
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將組織以深面朝下 (deep side down) 貼附於玻璃載玻片上。藉由輕壓檢體周邊使其與玻片接觸，並擠出任何氣泡，以確保組織與玻片表面完全貼合。此步驟可用冷凍噴霧 (freeze spray) 輔助，以防表皮翹起 (Fig. 29-11)。
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隨後塗上包埋介質如 OCT。接著將組織、包埋介質與玻片冷凍至約 −15° to −30 °C。此過程可借助 liquid nitrogen、tetrafluoroethylchloride 或 methoxynonafluorobutane，直到介質凍結（外觀轉為不透明），如 Figure 29-12 所示。
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在冷凍切片機 (cryostat) 的卡盤上放置少量包埋介質 (Fig. 29-13)。
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將檢體（仍在玻璃載玻片上）倒置於卡盤上，形成最終塊體。可再於玻片上添加額外的包埋介質 (Fig. 29-14)。此舉使檢體得以在 cryostat 內凍結附著於卡盤上。可於玻片上加裝銅製套件 (copper fitting) 或散熱片 (heat sink)。數分鐘後將玻片移除，即可顯露出平滑、水平的塊面，應能讓深部邊緣 (deep margin) 與表皮邊緣 (epidermal edge) 暴露於同一平面，以供 cryostat 切片。
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將檢體塊置入 cryostat，開始切割組織 (Fig. 29-15)。
若組織冷凍過慢，冰晶 (ice crystals) 可能在組織中留下孔洞。在潮濕環境下累積的凝結水 (condensate) 也可能造成冰晶形成，導致檢體出現裂縫與孔洞。若 cryostat 內的切割刀片不夠冷，或室內濕度過高，檢體可能發生捲曲 (curling)。
脂肪組織 (fatty tissue) 可能需要強力冷凍，這可能導致表皮冷凍假象 (epidermal freeze artifact)、組織斷裂 (tissue fractures) 與檢體碎裂 (specimen chipping) 增加。
圖 29-11：(A,B) 將上墨 (inked)、鬆弛後的組織以深部邊緣朝下放置於標示好的玻片上。以鑷子 (forceps) 將組織邊緣拉平壓貼於玻片上。(C) 許多時候需要冷凍噴霧 (freeze spray) 協助將組織以平整配置固定於玻片上。壓平很重要，如此表皮 (epidermis)、真皮 (dermis) 與皮下脂肪 (subcutaneous fat) 方能位於同一平面。
圖 29-12：(A) 組織以包埋化合物覆蓋，此處為 OCT，即 “optimal cutting temperature”（最適切割溫度）之縮寫。每一個案可指定不同顏色的包埋介質。此處使用黃色包埋介質。這是維持來自兩個不同部位或兩位不同病人之檢體辨識的一種方法。(B) 以一對鉗夾 (tongs) 將玻片浸入浴槽中。該浴槽維持約 −30°C 的溫度。
圖 29-13：在冷凍棒 (freeze bar) 上以包埋介質準備卡盤 (chuck)，此處為 optimal cutting temperature medium (OCT)。
圖 29-14：(A) 於組織上添加額外的包埋介質。(B) 將檢體倒置於卡盤上並加入更多包埋介質，使其進一步冷卻。(C) 使用散熱片 (heat sink) 或抽熱器 (extractor) 加速冷凍過程。數分鐘後，可將玻片自組織彈離以供包埋，使組織的手術邊緣 (surgical margin) 暴露於同一平面。若玻片不易自包埋介質與組織彈離，可用溫熱的拇指 (warm thumb) 加溫玻璃玻片，使其與冷凍塊分離。可塗上一層包埋介質薄膜填補塊面上任何開放間隙，以利切片更為平滑並防止組織脫塊 (chunking out)。
圖 29-15：玻片移除後，卡盤即可置入切片機 (microtome) 的物件夾持器 (object holder) 中。以帶有黑／銀色旋鈕的臂鎖緊，再以組織正右側的紅色把手 (red handle) 調整組織與刀片的角度。